Sbírka dvoukřídlých vznikla v letech 1906 a 1908, kdy byla do Národního muzea získána malá část sběrů Ferdinanda Kowarze (1838–1914), jednalo se o 18 krabic identifikovaného materiálu. Tento materiál, pocházející převážně ze Západních Čech, obsahuje dokladové exempláře k prvnímu seznamu českých dvoukřídlých (KOWARZ 1894). V roce 1925 byla získána sbírka Antonína Vimmera (1864–1941). Tato sbírka je tvořena 92 krabicemi určeného materiálu nasbíraného v Čechách a na Moravě. Obsahuje mnoho dokladových exemplářů k Vimmerovu seznamu českých dvoukřídlých (VIMMER 1913). Další přírůstky byly tvořeny sbírkou Alfreda Hetschko (1854–1933), včetně exemplářů z Česka a jižní Evropy (24 krabic identifikovaných exemplářů; získány v roce 1933). V roce 1939 byly získány dvě sbírky; sbírka čeledi kuklicovití (Tachinidae) Juraje Čepeláka (1917–2000) a část sbírky Dimitrije Jacentkovského (1898–1945).

V roce 1953 se prvním kurátorem dvoukřídlých Entomologického oddělení Národního muzea stal Josef Moucha (1930–1972). Byl známým specialistou na motýly i dvoukřídlé a nadšeným popularizátorem entomologie. Jeho sběrné a výměnné aktivity byly velmi produktivní a během let nashromáždil materiál dvoukřídlých z Česka a Slovenska, ze sousedních států (Rakousko, Německo, Maďarsko), z jihovýchodní Evropy (Albánie, Bulharsko a země bývalé Jugoslávie) a také Gruzie a Iránu. Josef Moucha byl hlavně vědecky zaměřen na dvoukřídlé čeledi ovádovití (Tabanidae) a roupcovití (Asilidae), částečně také na čeleď pestřenkovití (Syrphidae). Nejpočetnější částí sbírky dvoukřídlých je právě sbírka čeledi ovádovití, založená Josefem Mouchou a doplněná jeho kolegy (hlavně M. Chválou and J. Ježkem). Sbírka ovádovitých obsahuje více než 50000 kusů a okolo 100 typových exemplářů. Josef Moucha opublikoval 106 článků o dvoukřídlých, 96 článků o motýlech, 37 jiných článků a 11 knižních titulů. V roce 1971 se stal vedoucím Entomologického oddělení Národního muzea. Bohužel, jeho skvělá kariéra byla předčasně ukončena v roce 1972, kdy J. Moucha zemřel při dopravní nehodě.

Jan Ježek (*1945) byl kurátorem sbírky dvoukřídlých během let 1967–2011. Zpočátku spolupracoval s Josefem Mouchou na rozvoji sbírky dvoukřídlých a pracoval především na čeledi ovádovití. Nicméně později, v roce 1971, začal velmi intenzivně sbírat jedince čeledi koutulovití (Psychodidae) a pracovat na taxonomii této čeledi. Jeho první publikace vyšla o 6 let později (v roce 1977) a doposud s publikováním pokračuje. Nashromáždil velkou sbírku koutulovitých, uloženou v ethanolu a na preparátech v podobě mikroskopických sklíček v kanadském balzámu (více než 21000 exemplářů včetně 785 typových kusů). V 90. letech a po roce 2000 bylo získáno (nákupem či darem) několik různě velkých sbírek dvoukřídlých: coll. Jan Dirlbek (1930–2012) (vrtulovití – Tephritidae), coll. Jan Lellák (1926–1993) (pakomárovití – Chironomidae), coll. Jiří Olejníček (1946–2005) (lupicovití – Dolichopodidae), coll. Petr Laštovka (1938–2005) (bedlobytkovití – Mycetophilidae, smutnicovití - Sciaridae, octomilkovití - Drosophilidae, pamuchnicovití - Scatopsidae), coll. Helena Potměšilová– Karnecká (*1947) (břežnicovití – Ephydridae), coll. Milan Chvála (*1936) (ovádovití – Tabanidae), and coll. Jaromír Vaňhara (*1947) (stlačenkovití – Opetiidae a Platypezidae). Od roku 2011 sbírku dvoukřídlých spravuje Michal Tkoč (*1985). Vědecky je zaměřen na čeledi stlačenkovití (Platypezidae), bráněnkovití (Stratiomyidae) a lupicovití (Dolichopodidae), ve spolupráci také publikuje o čeledích lanýžkovití (Heleomyzidae), koutulovití (Psychodidae) ovádovití (Tabanidae) a jiné.