Sbírka brouků je nejrozsáhlejší kolekcí v rámci entomologického oddělení (EO) a obsahuje přibližně pět milionů exemplářů. Základem systematické sbírky brouků je sbírka tří generací Nickerlů, která mimo jiné obsahuje materiál nasbíraný E. Holubem na jeho cestách po Africe. Velmi cenná je sbírka J. V. Helfera, čítající přes 200 000 exemplářů, převážně nasbíraných v Tenasserimu. Největší nárůst sbírky brouků nastal s příchodem J. Obenbergera, který byl vůdčí osobností československé entomologie v první polovině minulého století a inicioval také vznik samostatného EO. Během 20. let vydal v novinách apel pro československé krajany žijící nebo často cestující do zahraničí s prosbou o sbírání hmyzu pro EO. Jeho apel se setkal s velkou odezvou a do EO začalo proudit množství materiálu. Mezi nejvýznamnější přispěvatele patřil J. Mráz, který během několika let zaslal do Prahy více než 300 000 exemplářů, převážně brouků, nasbíraných v okolí Sao Paula. Dalším takovým materiálem jsou sběry J. Bauma z celého světa, sběry z okolí Bagdádu známé lékařky V. Kálalové-di Lotty, či sběry B. Machulky z Afriky. Obenberger zároveň sám intenzivně sbíral brouky na území tehdejšího Československa i v okolních evropských státech a zorganizoval expedici do severní Afriky. Za jeho působení muzeum získalo množství rozsáhlých sbírek, za nejvýznamnější jmenujme alespoň sbírky J. Acharda, A. Fleischera, R. Formánka, E. Lokaje ml., B. Kouřila a F. Rambouska. V roce 1940 zaměstnal jako asistenta EO J. Bechyněho, který se významně podílel na zhodnocení sbírky mandelinek a popsal stovky nových taxonů. Sám Obenberger byl předním světovým specialistou na čeleď krasců (Buprestidae) a nashromáždil obrovskou sbírku čítající několik set tisíc exemplářů, která patří k nejucelenějším a největším sbírkám této skupiny na světě.

Od poloviny padesátých let minulého století muzeum získalo další cenné sbírky specialistů na vybrané skupiny brouků, např.: V. Balthasar, L. Heyrovský, J. Hlisníkovský, E. Jagemann, A. Jedlička, J. Král, A. Matějka, J. Pulpán, a A. Pfeffer. Recentně se podařilo zakoupit význačné sbírky M. Dvořáka, L. Hromádky a D. Krále. Darem získalo EO rozsáhlé sbírky S. Kadlece a S. Pokorného.

Zároveň sami pracovníci EO nasbírali velké množství exemplářů během nejrůznějších expedic, např. Turecko (1947), Írán (1970, 1973, 1977). Zejména expedice do Íránu byly pro sbírky velmi přínosné a EO tak vlastní pravděpodobně největší sbírku íránského hmyzu, čítající několik set tisíc exemplářů. Tehdejší zaměstnanci EO se taktéž velice zasloužili o rozvoj entomologických sbírek a patří nebo patřili mezi přední světové specialisty na vybrané čeledi brouků, S. Bílý (Buprestidae), J. Jelínek (Nitidulidae), V. Švihla (Oedemeridae, Cantharidae) a I. Kovář (Coccinellidae). V současné době se pracovníci EO nadále zabývají zpracováním a rozšiřováním sbírek. Věnují se především systematice vodních brouků (Hydradephaga, Hydrophiloidea) a mandelinkovitým (Chrysomelidae). Nejvýznamnějším počinem poslední dekády byla řada expedic na ostrov Sokotra, během kterých bylo nasbíráno velké množství nových druhů.

Sbírka brouků obsahuje několik desítek tisíc typových exemplářů a v současné době probíhá jejich katalogizace. Z hlediska typových exemplářů jsou nejcennější částí sbírky krasci díky intenzivní práci J. Obenbergera a S. Bílého a mandelinky, které těží z odkazu J. Acharda, jehož sbírka obsahuje také typové exempláře entomologických velikánů z 19. století.